2022年3月21日，暨南大学中医学院脑病个性化防治跨学科研究所陈刚教授课题组在《British Journal of Pharmacology》(BJP) 杂志上发表题为“Synergistic effects of two natural compounds of iridoids on rapid antidepressant action by up-regulating hippocampal PACAP signaling”的研究论文，揭示了中药复方越鞠丸的富集成分栀子苷与山栀子苷甲酯，通过协同作用产生快速抗抑郁作用的独特优势及激活该靶标的作用机制，为治疗抑郁症的新型药物研发提供创新策略。该论文的独立第一作者为我院中西医结合专业博士研究生张海楼，该研究课题负责人为脑病个性化防治跨学科研究所所长陈刚教授，该论文的共同通讯作者为南京中医药大学吴颢昕教授。

图1. 研究论文（图源：British Journal of Pharmacology）

【研究背景】

抑郁症（MDD）是给全球造成负担的主要疾病之一。目前主流的抑郁症药物治疗存在治疗效果的不稳定性，以及起效速度缓慢的缺点。最近有研究表明，单次剂量的氯胺酮足以快速并持久地缓解抑郁症患者的症状，而以往达到这种效果则需要使用如氟西汀等传统抗抑郁药物进行长期治疗。然而长期使用氯胺酮伴随着危险、被滥用的风险和其毒性，这使得研发具备快速抗抑郁效果的新型药物变得尤为迫切。

越鞠丸是金元时期的名医朱丹溪创制，由栀子、川芎、香附等五味中药组成，用于对治火郁、气郁等六种中医郁证病机，常用于抑郁症的治疗。研究表明，使用越鞠丸作治疗可产生与氯胺酮旗鼓相当的快速且持续的抗抑郁作用。与氯胺酮相似，越鞠丸透过抑制eEF2 （eukaryotic elongation factor 2）或激活mTOR（mammalian/mechanistic target of rapamycin）信号传导，刺激全局蛋白质的合成，并快速神经营养因子BDNF（brain-derived neurotrophic factor） 的表达，从而迅速促进海马体或前额叶皮质的神经可塑性。近期的一项研究表明，实时抑制蛋白激酶CaMKII（Ca/calmodulin-dependent protein kinase II） 的讯号传导在调节快速抗抑郁的效能方面，发挥着与eEF2 类似的作用。然而，关于越鞠丸如何具体调节与神经可塑性相关的信号传递效应的特定分子机制，目前尚待进一步的研究和探索。

先前的研究已经深入探讨了越鞠丸中的多种成分，特别是栀子，其作为最重要的成分之一，展现出显著的快速抗忧郁作用。在栀子中，环烯醚萜类（Iridoids）是一类高浓度的活性化合物，其中栀子苷与山栀子苷甲酯是两种最为主要的代表。

前期的研究结果表明，当以远高于越鞠丸中浓度的剂量重复服用栀子苷时，能够展现出抗抑郁的效果，而这种效果是单次服用时无法达到的。这表明了栀子苷在抗抑郁治疗中的潜在价值，并暗示了其需要一定的累积效应或持续作用。 

另一方面，山栀子苷甲酯则具有刺激神经组织的效果，在动物模型中被证实可以缓解焦虑或疼痛的症状，因此也显示出潜在的抗抑郁能力。值得注意的是，栀子苷与山栀子苷甲酯在结构上均含有三栀子甙甲酯，并且在C7和C8之间存在双键结构，这种结构相似性可能导致了它们相似的药理活性。基于这些发现，作者提出了一个假设：在越鞠丸中，栀子苷与山栀子苷甲酯可能通过协同作用，共同发挥快速抗抑郁的效果。

在此研究中，作者致力于深入探索越鞠丸中的有效成分及其在治疗抑郁症中的潜在作用机制。通过转录组学分析技术，他们发现越鞠丸能够显著上调海马体中的PACAP/PACAP-38（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide）的表达水平。PACAP是一种重要的神经肽，已知与抑郁症的调控密切相关。，越鞠丸中的两种主要成分——栀子苷与山栀子苷甲酯，在协同作用下，同样显示出上调PACAP表达的能力。为了更全面地理解这一作用机制，作者采用了多学科方法，深入研究了海马体中PACAP信号在栀子苷与山栀子苷甲酯快速抗抑郁作用中的角色。

【研究结果】

1. 海马区PACAP的表达及其在快速抗抑郁作用中的关键角色

为了深入探究越鞠丸快速抗忧郁作用的分子机制，作者在给予单剂量越鞠丸后的30分钟，他们对海马神经元细胞进行了转录组分析。通过RNA-seq分析，他们发现越鞠丸显著改变了多种基因的表达，特别是越鞠丸给药后显著上调了负责神经肽PACAP-38编码的基因Adyap1的表达。

作者进一步使用定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹分析进行验证，这些结果均证实越鞠丸能显著增加PACAP的表达。PACAP基因（Adyap1）和PACAP肽的表达在越鞠丸给药后30分钟时增强，但在2小时后恢复到基线水平。免疫染色结果显示，表达 PACAP 的神经元在海马齿状回的边缘中高度受限，这提示PACAP可能在特定脑区对越鞠丸的抗抑郁作用发挥关键作用。

为了验证PACAP在越鞠丸抗抑郁作用中的重要性，作者使用PACAP受体拮抗剂PACAP6-38对双侧海马进行微量输注，并通过尾悬挂实验（TST）和强迫游泳实验（FST）观察动物的行为绝望。结果显示，在给予越鞠丸后30分钟的TST和1天后的FST中，事先注射的PACAP6-38显著逆转了越鞠丸的抗抑郁效果，这证明了PACAP在越鞠丸抗抑郁作用中的关键作用。

此外，作者测试了双侧齿状回在微量输注 PACAP后（每个区域0.04 ng至4 ng）的抗抑郁效果。 他们发现，在输注PACAP 30分钟后，TST 的不动时间显著减少；在输注PACAP 1天后，FST 中检测到类似的效果。同时，在NFS 测试（一种用于测试快速抗忧郁药物潜力的行为范式）中的表现也有显著改善。另外，作者通过在一组独立的小鼠中持续微量输注PACAP（每个区域0.4 ng）来测试其抗抑郁效果的持续性。结果显示，在输注后第5天的TST、第7天的FST中，小鼠的不动时间显著减少；在第5天的NFS测试中，小鼠的表现均显著提升，这表明PACAP具有长期的抗抑郁效果。

图2. 越鞠丸能增加PACAP表达，有快速和持续性的抗抑郁效果（图源：British Journal of Pharmacology）

2. 栀子苷与山栀子苷甲酯的协同抗抑郁功效及其对PACAP信号转导的增强作用

通过深入的植物化学分析，作者确认了越鞠丸中栀子苷与山栀子苷甲酯的丰富含量，其等效剂量分别为44 mg·kr^-1和4.7 mg·kr^-1。为了探究这两种化合物在抗抑郁治疗中的潜在作用，作者以越鞠丸中相同剂量的栀子苷与山栀子苷甲酯为实验对象，分别或联合使用，测试了它们对抗抑郁作用和对海马体PACAP表达的影响。

实验结果显示，当高剂量的栀子苷与低剂量的山栀子苷甲酯联合使用时，在短短30分钟内即能迅速促使PACAP在基因水平和蛋白质水平上的表达发生改变，而单独使用时则未能观察到此效果。此外，这一组合在TST（尾悬挂实验）、FST（强迫游泳实验）和NSF（新环境摄食抑制实验）中均显示出显著的快速抗抑郁效果，而单独使用任一化合物在治疗后30分钟的TST、1天后的FST和2天后的NSF测试中均未观察到明显的治疗作用。

为了进一步验证这一组合的协同作用及其快速抗抑郁效果的持续性，作者使用另一组动物进行了实验。结果显示，治疗后30分钟时，NSF测试显著改善，证实了高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯单次给药后的快速抗抑郁作用。同时，TST显示抗抑郁效果持续至治疗后第3天，但在第5天的FST中不再显著。

为探究PACAP信号转导在此过程中的作用，作者在齿状回内通过PACAP6-38阻断PACAP信号。实验发现，这一操作在给药30分钟后的NSF测试中显著削弱了服用高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯后的快速抗抑郁反应，同样的情况也出现在治疗后2小时的TST和1日后的FST中。这一发现进一步证实了PACAP信号转导在高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯快速抗抑郁效果中的关键作用。

图3. 高剂量的栀子苷与低剂量的山栀子苷甲酯的协同快速抗抑郁效果，与PACAP信号转导在其中的重要性（图源：British Journal of Pharmacology）

3. PACAP表达神经元的光遗传学失活显著削弱了协同化合物的快速抗抑郁作用。

作者深入研究了双侧海马PACAP表达神经元在光遗传学失活后，对高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯协同抗抑郁效果的影响。为了实施光遗传学失活，作者在敲入PACAP的小鼠中使用了由腺相关病毒（AAV）介导的eNpHR3.0或控制载体。给药15分钟后，通过光遗传学手段抑制了PACAP表达神经元的活性。在光遗传学失活之前和期间进行的TST（尾悬挂实验）结果表明，高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的协同快速抗抑郁作用因PACAP神经元的失活而显著减弱。这一发现进一步强调了PACAP信号通路在抗抑郁机制中的核心作用。

为了评估协同抗抑郁效果的持续性，作者在光遗传学失活后的不同时间点进行了多种行为测试，包括FST（强迫游泳实验）、NSF（新环境摄食抑制实验）和SPT（蔗糖偏好测试），以观察快感缺失的行为表现，这是抑郁症的核心症状。结果显示，在光遗传学失活后的1至3天内，小鼠的抑郁症行为逐渐增加。然而，值得注意的是，在FST测试中，高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的协同抗抑郁作用在失活后1天内并未受到显著影响。

具体而言，在第2天的NSF测试中和第3天的SPT中，观察到协同抗抑郁作用仍然有效，表现为进食延迟的减少和食物消耗量的增加。然而，在OFT（开放场实验）中，小鼠的运动活动和焦虑性行为并未发生显著变化，这表明光遗传学失活主要影响了与抗抑郁相关的特定行为，而非整体的活动或焦虑水平。

图4. PACAP表达神经元的光遗传学失活只短暂削弱了协同化合物的快速抗抑郁作用（图源：British Journal of Pharmacology）

4. 栀子苷与山栀子苷甲酯的协同作用通过抑制CaMKII信号转导，触发显著的快速抗抑郁效果

作者深入探究了高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯给药后不同时间点（10、20和30分钟）对海马中PACAP蛋白合成信号表达的影响。单次给药后20分钟时，观察到PACAP的表达量显著上调，同时磷酸化的CaMKII的表达受到显著抑制。此外，在这一时间点，mTOR、BDNF、4EBP1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1）以及P70S6K的表达均显著上调。值得注意的是，CaMKII信号转导的抑制和BDNF的上调在给药后30分钟依然保持，而在10分钟时这些分子信号转导的表达并未发生显著变化。在整个实验过程中，eEF2的信号传导未观察到显著变化。值得一提的是，当栀子苷与山栀子苷甲酯分别单独给药时，并未观察到上述效果。

基于这些发现，作者推测CaMKII信号转导的抑制在介导高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的协同快速抗抑郁效果中起到了关键作用。为了验证这一假设，作者采用了NSF实验来测试给药后30分钟的快速抗抑郁作用，并通过TST来评估2小时后的持续抗抑郁作用。在齿状回内注射CaMKII信号通路的激活剂钙调蛋白CALM后，发现这一操作选择性地削弱了高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的协同快速抗抑郁作用。然而，对于这两种化合物协同产生的持续性抗抑郁作用，齿状回内注射CALM并未产生显著影响。

在分子层面，CALM的注射阻止了高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯协同上调BDNF表达的作用。这一发现进一步支持了CaMKII信号转导在协同抗抑郁效果中的核心作用，并揭示了BDNF上调可能是这一协同作用的关键下游效应之一。

图5.  栀子苷与山栀子苷甲酯的协同作用通过有效抑制CaMKII信号转导，显著触发了快速抗抑郁效果（图源：British Journal of Pharmacology）

5. 栀子苷与山栀子苷甲酯的协同作用能够迅速使忧郁症小鼠模型中的PACAP及相关信号转导回归正常状态

为了验证高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的快速抗抑郁协同作用，并探究海马PACAP水平及相关信号转导与抑郁行为之间的关联，作者首先通过重复性皮质酮给药，建立了一个有效的慢性抑郁症小鼠模型。在单次给予高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯后，作者对接受皮质酮处理的动物进行了行为反应和分子信号的评估。在急性应激模型中，单次给予高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯并未在行为层面和分子层面上产生显著效果，因此这部分数据并未纳入后续的皮质酮实验中。

经过4周皮质酮给药后，小鼠在SPT、TST和FST中均表现出了明显的抑郁症症状。然而，单次给予高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯能够显著逆转这些症状，表明其快速抗抑郁作用。在长期注射皮质酮的情况下，小鼠在高架十字迷宫测试（EPM）中开放臂停留时间减少，反映了焦虑水平的增加。而高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的协同作用显著改善了这一情况，提示其对抗焦虑的潜在作用。相比之下，在OFT中，无论是皮质酮注射还是高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯的治疗，均未观察到显著的行为变化。

在分子层面，长期给予皮质酮显著降低了海马PACAP的表达，而单次给予高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯能够逆转这一变化，将其恢复至正常水平。此外，长期皮质酮给药还会减弱mTOR信号转导、pCaMKII/CaMKII和BDNF的表达，但在给予高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯30分钟后，这些分子信号均恢复到了正常水平。此外，长期给予皮质酮的小鼠在给予高剂量栀子苷与低剂量山栀子苷甲酯30分钟后，PKA/CREB和PSD95、pEEF2/eEF2的蛋白质表达水平也呈现正常化，进一步证明了这两种化合物在调节抑郁相关分子信号中的重要作用。

图6.  高剂量的栀子苷与低剂量的山栀子苷甲酯的协同作用显著促进了抑郁症小鼠模型中PACAP及相关信号转导的快速正常化（图源：British Journal of Pharmacology）

【研究总结】

此研究深入探索了越鞠丸中栀子苷与山栀子苷甲酯在安全剂量下的协同作用及其快速抗抑郁机制，首次揭示了抑制CaMKII信号转导与mTOR信号转导短暂活化的紧密联系，而非与eEF2信号转导的抑制相关的新证据。这一发现证实了PACAP及其相关的CaMKII-BDNF信号通路在越鞠丸及栀子苷与山栀子苷甲酯快速抗抑郁作用中的核心地位，为开发基于该机制的新型快速抗抑郁药物提供了宝贵的参考数据。

中药复方中多成分的相互作用是其基础性作用机理之一，然而，关于这些成分的靶向性协同研究尚显不足。此研究不仅为越鞠丸的快速抗抑郁作用提供了新依据，而且在解决中药复方研究中诸如新生物学机制发现与验证、关键协同性物质成分标定等难题上取得了显著进展，对推动中药复方研究及其临床应用具有重要意义

原文链接：https://doi.org/10.1111/bph.15847