心血管疾病（CVD）一直是紧迫的公共卫生问题，占全球死亡人数的30%以上，血液中胆固醇水平升高，特别是低密度脂蛋白胆固醇，可显著增加动脉粥样硬化发生的风险。2024年3月18日，清华大学王一国副教授以及南方医科大学张惠杰教授等科研团队在国际顶尖期刊Cell上发表题为A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism的研究论文，揭示了一种新型肠道分泌激素Cholesin通过调节胆固醇稳态预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化的作用机制，可为临床CVD治疗新型药物的研发提供创新策略。

【研究背景】

       胆固醇稳态由各种组织协调，以维持饮食中胆固醇吸收、从头合成、胆汁清除和排泄之间的平衡，膳食和胆汁胆固醇都可被肠细胞的NPC1L1蛋白吸收，吸收的胆固醇被包装成乳糜微粒，释放到淋巴管，最终到达循环系统。肝脏是胆固醇合成的主要部位，胆固醇在一系列酶的控制下由CoA（acetyl-coenzyme A）产生，其中，HMGCR(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase）是限速酶，其活性在转录和转录后水平上都可受到调控，SREBP2（Sterol regulatory element-binding protein 2）则是主要调控HMGCR和其他参与胆固醇合成和摄取基因表达的转录因子。胆固醇的生物合成和摄取是通过严格的负反馈机制调节的。当细胞缺乏胆固醇时，SREBP2及其伴侣蛋白SCAP（SREBP cleavage-activating protein）借助COPII（coat protein complex II）从内质网（ER）转运到高尔基体。在高尔基体中，SREBP2依次被两种蛋白酶切割，SREBP2的N端结构域通过这种切割释放，到达细胞核，在那里它作为转录因子发挥作用，增强参与胆固醇合成和摄取的基因的表达。相反，当细胞胆固醇水平升高时，胆固醇分子与SCAP结合，触发其与INSIG（insulin-induced gene）的相互作用，这种相互作用将SREBP保留在ER中，并阻止随后SREBP的激活和胆固醇代谢相关基因的表达，从而有助于维持胆固醇稳态。尽管人们对胆固醇水平以及胆固醇稳态的调节机制已经较为了解，但对胆固醇以外的其他信号如何影响胆固醇合成的理解仍然有限。

       众所周知，胆固醇合成和吸收之间的相互关系可以调节循环胆固醇，以应对饮食或胆固醇干预。尽管如此，负责协调胆固醇吸收和合成之间平衡的特定因素，以及这些因素如何精确调节平衡，仍知之甚少。在该研究中，研究人员鉴定了一种新型肠道来源的激素，并将其命名为Cholesin。机制研究表明，Cholesin结合其受体GPR146 (G protein-coupled receptor 146)，抑制PKA/ERK1/2信号轴和SREBP2控制的胆固醇合成途径。该研究表明Cholesin-GPR146轴是肠道吸收胆固醇和抑制肝脏中胆固醇合成之间的分子联系，且Cholesin有望用于治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化。

【研究结果】

1. Cholesin是一种胆固醇诱导的肠道激素

       为了研究肠道胆固醇吸收以及肝脏胆固醇合成之间的潜在联系，研究人员设计了一批动物实验，采用过夜禁食的小鼠，分别喂养普通饲料（RD：0.02%胆固醇）和西式高胆固醇饲料（WD：1.25%胆固醇），目的是提高小鼠对总胆固醇的吸收来达到发挥对胆固醇合成最大限度的抑制作用。结果表明，WD饮食下，小鼠肠道内胆固醇水平增加，表明其肠道内胆固醇吸收增加；而肝脏和血浆中胆固醇的水平直到喂食4h后才显著增加。其他指标如TG、血糖和胰岛素水平与之前的研究报道一致。另一方面，肠道中胆固醇合成标志物HMGCR的表达下调，这表明了胆固醇合成的负反馈调节机制。无论是mRNA还是蛋白水平，RD和WD喂养后肝脏HMGCR的表达均呈现出显著下降的趋势，随后又恢复，其中WD饮食具有更强的抑制作用。这些结果表明，除了胆固醇之外，还有其他因素参与调节肠道胆固醇吸收后的肝脏胆固醇合成。随着时间的推移，HMGCR表达的增加可能归因于进食诱导的SREBP2激活和HMGCR蛋白水平的转录后调控。

       为了确定参与调节肠道胆固醇吸收和肝脏胆固醇合成的调节因子，研究人员对禁食16小时后喂养RD或WD 1小时的小鼠血浆蛋白进行了分析。结果表明，在WD喂养后，分子量23kDa附近有一个增强的条带，质谱检测显示该蛋白为未鉴定的人源蛋白C7orf50的同源物。该蛋白在物种间表现出高度的保守性，在人和小鼠之间具有64.17%的同源性，但其具体功能尚不清楚，研究人员将其命名为“Cholesin”。进一步，研究人员考察喂食对Cholesin的影响，发现WD喂食1小时后达到峰值，RD饮食也引起了类似的变化，更重要的是在人类的血液中也发现了类似的现象。这些结果表明Cholesin是在进食反应中分泌的，胆固醇可能是其诱导剂。

       为确定哪些组织在喂食后分泌Cholesin，作者构建了Cholesin敲除鼠，通过WB实验，发现Cholesin在小肠和结肠组织中高表达，基于此，研究者构建了肠道特异性敲除鼠（IKO小鼠）。考虑到血浆胆固醇水平在喂食1h后达到峰值，研究者在禁食16h再喂食1h后对WT鼠和敲除鼠肠道和血浆的Cholesin等进行考察，IKO小鼠Cholesin水平并不会随着喂食而增加；另外，WT鼠和IKO鼠同时喂养胆固醇时，IKO小鼠的Cholesin水平也不会增加。这些结果证明Cholesin是一种肠道来源的激素，并可对胆固醇的吸收产生反应。

图2. WD饮食促进Cholesin分泌（图源：Cell）

2. NPC1L1介导的胆固醇摄取促进Cholesin分泌

       胆固醇是通过在肠上皮细胞顶端表面的NPC1L1进行吸收的。研究人员假设胆固醇吸收诱导的Cholesin可能在肠上皮细胞中表达。为了验证这一观点，研究人员构建了Cholesin-GFP敲入小鼠，并将它们与Apoa1-mCherry敲入小鼠杂交。结果显示，Cholesin-GFP与APOA1-mCherry共定位，这表明Cholesin在肠细胞中表达。为了研究胆固醇是否直接影响Cholesin分泌，研究人员评估了在人结直肠癌细胞（HCT116细胞）中不同胆固醇水平对Cholesin分泌的影响。随着胆固醇浓度的增加，Cholesin的分泌随之增加。此外，敲低HCT116细胞中NPC1L1的表达则可破坏胆固醇吸收和Cholesin分泌。以上结果说明，NPC1L1介导的胆固醇摄取可增加Cholesin分泌。

       接下来，研究人员通过采用NPC1L1抑制剂（Ezetimibe）以及敲除NPC1L1来探究Cholesin分泌是否依赖于NPC1L1。结果显示，抑制NPC1L1可显著阻断肠道胆固醇吸收和Cholesin分泌。为研究胆固醇如何刺激Cholesin分泌，研究人员发现GW4869（一种已知的抑制外泌体生成和减少外泌体释放的药物），在胆固醇存在的条件下，可抑制Cholesin分泌。研究人员进一步证实，Cholesin通过外泌体分泌，但还需要进一步的研究来揭示胆固醇刺激外泌体释放的机制以及Cholesin将自身锚定在外泌体的过程。

图3. NPC1L1介导的胆固醇吸收可增强Cholesin分泌（图源：Cell）

3. Cholesin调节人体血浆胆固醇水平

      Cholesin位于人类7号染色体（Chr7）的p22区域，该区域与各种人群中的高胆固醇血症密切相关。为了确定Cholesin和血浆胆固醇水平之间的相关性，研究人员对六百人的血浆Cholesin和胆固醇水平进行了测量。结果显示，血浆Cholesin水平与总胆固醇（TC）和LDL-C呈负相关，而与高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平无显著相关性。此外，血浆Cholesin水平与TG水平呈负相关，Cholesin与APOB有显著相关性。以上数据表明，Cholesin和血浆胆固醇水平之间存在密切联系。

      随后，研究人员对两种已鉴定的SNP（rs10236293和rs1007765）进行考察，有趣的是，在多个细胞系中发现这两个SNP都定位于顺式调控元件（CRE）。两种CREs均表现出对DNase I的超敏反应和表观遗传修饰如H3K4me3和H3K27ac的富集，这表明开放的染色质构象激活了基因表达。携带任意一个SNP的个体其血浆胆固醇水平升高，血浆TC和LDL-C水平降低。通过构建CRE敲除细胞，研究人员发现Cholesin可能降低人类血浆胆固醇水平。

图4. Cholesin可调节人血浆中胆固醇水平（图源：Cell）

4. 敲除Cholesin可增加肝脏胆固醇合成和极低密度脂蛋白分泌

       基于Cholesin与胆固醇之间的关系，研究人员聚焦于Cholesin在胆固醇代谢中的作用。采用RD/WD饮食喂养雌雄IKO鼠8周，其胆固醇水平均高于WT鼠，同时TG水平也略有升高，肝脏中相应指标水平也显著升高；IKO小鼠的HDL-C、LDL-C和VLDL-C均升高。这些结果表明，Cholesin缺乏会导致血浆胆固醇水平升高。Cholesin IKO小鼠血浆胆固醇水平升高可能源于多种因素，包括肠道胆固醇吸收增强、肝脏胆固醇合成、VLDL分泌增加、组织摄取清除率降低以及胆汁和胆固醇的胆道排泄改变。研究人员通过一系列实验证实，肝脏胆固醇合成和VLDL分泌的增加可能是导致Cholesin IKO小鼠血浆胆固醇水平升高的原因。

图5. Cholesin缺乏可增强肝脏胆固醇合成并促进VLDL分泌（图源：Cell）

5. GPR146是Cholesin的受体

为了确定Cholesin的靶组织，研究人员将纯化的Cholesin与不同小鼠组织进行结合实验。结果显示，肝脏、脂肪组织、肾脏和骨骼肌中结合信号更强。在鉴定Cholesin受体时，研究人员使用流式细胞术来评估不同细胞系结合Cholesin的能力。结果表明，MCF7（人乳腺腺癌细胞系）与Cholesin结合最强。进一步，研究人员使用慢病毒文库在MCF7细胞中进行了全基因组筛选，该文库包含65383个靶向19050个编码人类基因蛋白质的signal-guide RNA （sgRNAs），21864个靶向microRNAs的sgRNAs，以及3000个非靶向对照的sgRNAs。研究人员从Cholesin结合缺失的细胞中收集了基因组DNA，对sgRNAs进行测序和分析。最后确定的首选候选基因是GPR146。

为了确定GPR146是否是Cholesin的受体，研究人员考察了Cholesin在小鼠组织或原代肝细胞中的结合能力。实验证实，Cholesin与GPR146具有高度亲和力。机制研究表明，Cholesin处理破坏了GPR146与GNAI1蛋白之间的相互作用，这种作用被GPR146的Cholesin结合缺陷突变体减弱。与上述结果一致，Cholesin处理降低了WT原代肝细胞的细胞内cAMP水平，但在GPR146敲除的原代肝细胞中没有此现象。上述结果表明Cholesin通过GPR146偶联Gαi信号通路抑制cAMP的产生。

图6. GPR146是Cholesin的受体（图源：Cell）

6. Cholesin以GPR146依赖的方式抑制胆固醇合成

       Cholesin以剂量依赖性的方式抑制肝脏HMGCR的表达，研究人员比较了单次和多次腹腔注射Cholesin对肝脏HMGCR表达、血浆胆固醇水平和肝脏胆固醇水平的影响，发现多次注射Cholesin抑制肝脏HMGCR表达的作用更为明显，且血浆和肝脏胆固醇水平显著降低。GPR146作为Cholesin受体，但Cholesin是否通过GPR146抑制小鼠胆固醇合成还不能确定。研究人员通过多次注射Cholesin到小鼠体内，发现Cholesin注射降低了WT小鼠的胆固醇生成基因表达、肝脏胆固醇含量和血浆TC水平。此外，Cholesin降低了TG水平，但对体重和食物摄入量没有影响。有研究表明，血浆胆固醇水平主要受肝源性GPR146的影响，因此，研究人员采用腺病毒特异性下敲肝脏中GPR146（GPR146 LKO）表达，与先前结果一致，GPR146 LKO小鼠表现出胆固醇合成、血浆TC和血浆TG的降低。重要的是，Cholesin对GPR146 LKO小鼠胆固醇合成和血浆TC水平的抑制作用被减弱，在肝脏中过表达GPR146则可恢复Cholesin对TC和TG水平的抑制作用。综上所述，GPR146对于Cholesin降低胆固醇合成至关重要。

       GPR146已被证明通过激活ERK1/2通路刺激胆固醇合成。然而，Cholesin对cAMP/PKA的调节是否通过ERK1/2通路仍不确定。研究人员发现，在GPR146 LKO小鼠中ERK1/2通路被抑制。Cholesin在WT小鼠中可降低cAMP/PKA信号，但在GPR146 LKO小鼠中该作用被逆转。同样，Cholesin以GPR146依赖的方式抑制小鼠的ERK1/2信号通路。进一步，研究人员在Cholesin IKO小鼠中腹腔注射MEK抑制剂PD0325901，发现该抑制剂可显著降低Cholesin IKO小鼠胆固醇合成基因的上调和血浆TC水平的增加。以上结果表明，Cholesin可在一定程度上通过ERK1/2信号通路抑制胆固醇合成。

图7. Cholesin通过GPR146抑制胆固醇合成（图源：Cell）

7. Cholesin可预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化

       他汀类药物是治疗高胆固醇血症的常用处方药，它们通过抑制HMGCR活性、增加LDLR介导的胆固醇摄取来减少胆固醇合成。然而，他汀类药物由于能够显著增加HMGCR和其他胆固醇生成基因的表达而受到众多科学家的质疑。基于Cholesin可显著抑制胆固醇合成，研究人员探究了Cholesin单独使用或与瑞舒伐他汀（Ros）联用是否可以改善小鼠模型动脉粥样硬化。结果表明，给予Cholesin可显著降低胆固醇生成基因表达和血浆TC水平，同时可显著减少动脉粥样硬化病变。         另一方面，Ros处理也可降低胆固醇合成、血浆TC水平和动脉粥样硬化病变，但胆固醇生成基因表达上调。Cholesin和Ros联用则减轻了单独使用Ros诱导的胆固醇合成代偿性增加，从而对血浆TC和动脉粥样硬化病变产生更明显的抑制作用。上述结果表明，Cholesin单独或与他汀类药物联用对高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有显著的保护作用。

图8. Cholesin可预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化（图源：Cell）

【研究总结】

图9. 机制图（图源：Cell）

     该研究首次发现了一种新型肠道激素——Cholesin，通过完整的实验技术手段揭示了Cholesin-GPR146轴调控机体胆固醇稳态的作用机制，该激素有望成为对抗高胆固醇血症和动脉粥样硬化的有效药物。