非酒精性脂肪肝病（NAFLD）
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研究知识点
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是全球最常见的慢性肝病，由于肥胖的流行，预计其发病率在未来几十年将进一步攀升。NAFLD包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎（NASH）、肝纤维化、肝硬化及肝癌（HCC），其中，NASH可发展为肝纤维化甚至肝癌，其发病人数逐年上升，给社会带来了巨大的经济和医疗负担，目前还没有已批准的药物可以专门针对NAFLD/NASH/HCC这一进展过程。近年来，间歇性禁食或其他形式的饮食调整方法作为对抗肥胖等代谢相关疾病的预防措施越来越受欢迎，但其中的分子机制不甚明了。因此，探究并阐明禁食方法缓解NASH/HCC进程的作用机制，可为临床针对NAFLD/NASH/HCC进程治疗提供新思路。
图1. 研究论文（图源：British Journal of Pharmacology）
2024年5月7日，德国癌症研究中心Mathias Heikenwalder团队于Cell Metabolism期刊发表一篇题为“A 5:2 intermittent fasting regimen ameliorates NASH and fibrosis and blunts HCC development via hepatic PPARα and PCK1”的研究论文，揭示了5﹕2的间歇性禁食方案改善NASH及肝纤维化的作用机制。
【研究结果】
1. 间歇性禁食（IF）可预防饮食引起的肥胖和NASH进展
研究人员采用WD（西方）饮食构建NASH小鼠模型，考虑到小鼠主要在夜间活动，IF（5:2）组小鼠在每周的周一和周四、分别从晚上7点开始禁食24小时（不禁水），其余时间可自由进食及饮水。WD饮食喂养32周后，与不限饮食的小鼠（A/L组）对比，IF（5:2）组小鼠脂肪量减少、去脂体重/体重比更高、血清胆固醇和空腹血糖降低、肝损伤标志物（血清ALT/ALP）比值降低、肝脏指数下调、NAS score降低，另外，IF（5:2）组小鼠的纤维化及炎症水平也显著降低。这些研究结果表明，IF（5:2）方案可缓解饮食引起的小鼠代谢功能障碍，减轻NASH发展。
图2. 间歇性禁食（IF）可预防饮食引起的肥胖和NASH进展（图源：Cell Metabolism）
2. 禁食所带来的益处与总卡路里摄入量无关，但取决于禁食周期的长短
研究人员发现，IF（5:2）方案并不会影响小鼠的总热量与饮水量，但小鼠的脂肪酸氧化能力提高，说明IF（5:2）组小鼠全身代谢情况发生了改变。因此，研究人员进一步探究禁食方案缓解NASH进程的内在影响因素。首先，研究人员采用较温和的CD-HFD（胆碱缺乏高脂饮食）饮食构建NASH小鼠模型（该饮食与WD饮食相比纤维化程度较轻，可使研究人员更好的分析禁食疗法的复杂性），采用两种禁食方案，IF（5:2-12 h）组和IF（6:1-24 h）组。IF（5:2-12 h）组指小鼠于每周的周一和周四分别禁食12小时，从晚上7点禁食至早上7点；IF（6:1-24 h）组指小鼠于每周四禁食24小时，从晚上7点禁食至第二天晚上7点。这两种禁食方案的总禁食时间一致。结果显示，IF（6:1-24 h）组较IF（5:2-12 h）组能更好的缓解小鼠肝损伤并改善小鼠全身代谢，这表明，在禁食总时间一致时，禁食周期的持续时长起着更重要的作用。
图3. 禁食所带来的益处与总卡路里摄入量无关，但取决于禁食周期的长短（图源：Cell Metabolism）
3. 开始禁食的时间和禁食周期的数量决定了禁食在NASH发病机制中的调控作用
为了更深入的研究禁食周期的复杂性，研究人员探讨每周禁食周期的数量以及禁食的开始时间是否会对禁食方案产生影响。研究人员采用WD饮食构建NASH小鼠模型，WD饮食较CD-HFD饮食产生的造模效果更严重，可能需要更多的禁食周期，因此，研究人员采用了三种禁食方案，IF（6:1, 7 p.m. to 7 p.m.）组、IF（6:1, 7 a.m. to 7 a.m.）组和IF（5:2, 7 a.m. to 7 a.m.）组。结果显示，这三种禁食方案在改善小鼠肝损伤与全身代谢方面均没有显著差异。
上述两点结果表明，有四个关键因素参与了禁食方案对NASH的改善作用：禁食开始的时间、禁食周期的持续时长、禁食周期的数量和饮食成分。
图4. 开始禁食的时间和禁食周期的数量决定了禁食在NASH发病机制中的调控作用（图源：Cell Metabolism）
4. PPARa是NASH禁食反应的主要调节因子
接下来，研究人员探究IF调控NASH的内在机制，采用饮食构建NASH小鼠模型5周，分为三组，正常饮食组（进食状态下取材）、IF（5:2）组（禁食状态下取材）和IF（5:2）组（禁食后重新喂养4小时后取材），从而阐明参与禁食和重新进食后的关键信号通路。研究人员对这三组小鼠的肝脏进行蛋白质组学分析，发现糖异生关键酶（PCK1和VNN1）、脂肪酸氧化途径相关酶（CYP4A10、CYP4A14、ACOT2和CROT）和生酮限速酶（HMGCS2）在禁食期间均显著上调，而从头脂肪生成相关酶（FASN和SCD1）则显著下调。GSEA分析显示，禁食小鼠的脂肪酸代谢和PPAR信号通路显著富集，IPA分析显示了脂肪酸氧化、生酮反应和PPARα/RXRα激活的富集，并发现PPARα是禁食反应的中心调节剂。由于禁食反应不仅仅由PPARα协调，还涉及多种转录因子和激素，例如糖皮质激素（GC）和糖皮质激素受体（GR）等的复杂相互作用。有研究表明，禁食期间肝脏的转录调节需要GR轴和PPARα信号通路的共同调节作用。研究人员发现，经典的PPARα和GR靶基因，如PDK4、FKBP5和MT2α，在禁食期间显著增加，而重新喂养后迅速下降。另外，在正常饮食的NASH模型组中，PPARα靶基因PDK4和PCK1显著下调，同时，NASH患者肝脏中PDK4和PCK1的mRNA和蛋白水平表现出同样的情况。以上结果提示了PPARα靶基因和PCK1在禁食方案调控NASH进程中的重要性。
图5. PPARa是NASH禁食反应的主要调节因子（图源：Cell Metabolism）
5. 只有在活动期（晚上7点至晚上7点）开始的禁食才能强烈诱导糖皮质激素信号传导和PCK1表达
为了深入研究禁食开始时间对PPARα或糖皮质激素信号传导的作用，研究人员采用了IF（5:2, 7 p.m. to 7 p.m.）组和IF（5:2, 7 a.m. to 7 a.m.）组，分别喂养WD饮食5周。结果表明，IF（5:2, 7 p.m. to 7 p.m.）组也就是小鼠活动期开始禁食时，对肝脏的影响更加显著，糖皮质激素和AMPK信号通路上调更为明显。
图6. 只有在活动期（晚上7点至晚上7点）开始的禁食才能强烈诱导糖皮质激素信号传导和PCK1表达（图源：Cell Metabolism）
6. PPARa和PCK1在NASH的IF方案中起着关键作用
前期结果显示，PPARα激活是肝脏禁食反应的核心要素，因此，研究人员研究PPARα激动剂pemafibrate是否可以模拟禁食诱导的肝脏信号通路。值得注意的是，目前没有可用的药物来激动PCK1。数据结果表明，PPARα激动部分模拟了肝脏禁食反应，但不足以完全重现这一过程，特别是在诱导脂肪酸分解代谢同时抑制合成代谢脂肪生成方面。这也与上述一致，表明PPARα和GR-PCK1的协同作用介导了肝脏禁食反应。
进一步，研究人员研究PCK1单独过表达或与PPARα一起过表达是否可以预防WD引起的体重增加和肝损伤。结果显示，PCK1单独过表达就可以减弱小鼠单纯性非酒精性脂肪肝病（NAFL）发生发展。值得注意的是，与使用pemafibrate不同，单独过表达PPARα可能不会激活PPARα。
图7. PPARa和PCK1在NASH的IF方案中起着关键作用（图源：Cell Metabolism）
7. 治疗性IF方案可逆转NASH发展并可减少NASH向HCC的转变
最后，研究人员探讨了治疗性IF（5:2）方案对NASH进程的影响，采用WD或CD-HFD饮食分别喂养小鼠5个月后，开始IF（5:2）方案，维持4个月，造模时长共9个月。结果表明IF（5:2）方案均可改善这两种模型诱导的NASH进展。进一步，研究人员探究IF方案是否可以阻止NASH向HCC的转变。分别采用WD饮食（5个月）和CD-HFD饮食（8个月）构建NASH小鼠模型后，进行IF（5:2）方案，总造模周期共15个月。结果显示，IF（5:2）方案可显著缓解HCC的发展。
图8. 治疗性IF方案可逆转NASH发展并可减少NASH向HCC的转变（图源：Cell Metabolism）
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研 究 总 结
图9. 机制图（图源：Cell Metabolism）
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鉴于目前尚无有效干预NASH/HCC发展的药物，如间歇性禁食（IF）的饮食调节方法愈来愈受人们的青睐，该研究通过模拟人类NASH/HCC发生发展过程，详细阐述了IF（5:2）方案在预防和治疗NASH及相关纤维化或HCC的有益效果，并阐明了内在机制，可为NASH的干预方案提供巨大的治疗价值。
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原文链接：https://doi.org/10.1016/jNaNet.2024.04.015
