QUESTION

ANSWER

      首先，研究团队利用了单细胞RNA测序技术，通过对9名接受升主动脉置换术的STAAD患者（四名急性AD，三名亚急性AD和两名慢性AD）及5名接受心脏移植的对照个体进行比较分析，发现了合成型平滑肌细胞（SMCs）在AD中的显著变化。确定了合成型SMCs是AD中的一个新兴集群，并通过对比合成型SMCs与所有主动脉细胞的比例证实了该集群在AD中的增加。

      主动脉中膜层SMCs对于维持主动脉壁的正常结构及功能尤为重要。收缩型SMCs向合成型SMCs转化的过程是AD的发生的关键病理学改变。然而，关于SMCs表型转化的确切机制至今仍然不明。为了探究合成型SMCs的潜在起源和病理特征，作者对所有的非免疫细胞进行了重新聚类，得到17个亚群，包括4个SMCs亚群。其中，收缩型SMCs表达经典的收缩相关基因，而其他3个亚群收缩相关基因表达量相对较低。合成型SMCs又被分为3个亚型：纤维样SMCs（Fibro-like SMC）、脂肪样SMCs（LipoSMC）和纤维肌细胞（Fibromyocyte）。细胞比例分析表明，收缩型SMCs在AD中占比显著降低，而合成型SMCs比例显著升高；轨迹推断分析表明，收缩型SMCs是3种合成型SMCs的起源。

      AD的不同疾病阶段显示出不同的病理特征。急性和亚急性组中分离出的SMCs收缩型基因表达评分低于慢性组，合成型基因表达评分高于慢性组；急性和亚急性AD中的表型转换评分和合成型SMCs的相对细胞数量都比慢性AD高，提示 SMCs在AD不同阶段存在特异性表型转换。细胞外基质的重构和降解是AD的关键特征，拟合曲线分析表明AD中存在疾病阶段特异性细胞外基质重构。此外，人升主动脉样本的分析进一步证实急性和亚急性AD中收缩相关基因表达下调，合成相关基因表达上调。以上分析均表明SMCs在AD中存在疾病阶段特异性表型转换。

      为了确定推动表型转换的主要调控因子，研究者首先通过比较收缩型SMCs与合成SMCs集群的基因表达，筛选出属于转录因子（TFs）的差异表达基因（DEGs）。发现AP-1的多个亚基，包括FOS、FOSB、JUN、JUNB和JUND，在纤维样SMCs和脂肪样SMCs中升高，而在收缩型SMCs中则较低。单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC）分析显示，转录因子AP-1及其靶基因在纤维样和脂肪样SMCs集群中处于活跃状态。此外，作者观察到AP-1的升高沿着发育轨迹在急性和亚急性AD组中发生。哺乳动物细胞中，AP-1是一种由FOS和JUN家族成员组成的转录因子复合物，调控基因转录从而影响细胞增殖、分化和凋亡等关键生理过程。染色质免疫沉淀（ChIP）分析结果显示，JUN结合在COL5A1、COL1A1、COL1A2和ApoE等合成型基因的启动子区，进一步验证了AP-1在SMCs表型转换中的作用。利用AP-1激活剂12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate（TPA）处理人主动脉SMCs细胞显著上调合成型基因，同时下调收缩型基因；AP-1抑制剂T-5224则出现相反的效果，以上研究结果表明AP-1的升高和激活促进了AD中合成型SMCs的增加。

      接下来，作者探索了促进AP-1介导的表型转换的上游调节因子。差异表达基因和通路分析显示，与纤维样和脂肪样SMCs相比，收缩型SMCs中腺苷酸三磷酸（ATP）代谢过程和氧化磷酸化（OXPHOS）富集。使用六种典型线粒体相关特征和OXPHOS基因集进行打分，富集趋势与发育轨迹高度一致，尤其在急性和亚急性AD中，表明OXPHOS可能负调控合成型SMCs的增加。为了验证这一点，作者利用线粒体复合物1特异性抑制剂鱼藤酮（Rotenone）处理SMCs细胞，发现其可以显著提高AP-1的表达、磷酸化和核转位。而添加OXPHOS必需辅因子辅酶Q10 （CoQ10）则显示出相反的效果。ChIP结果显示，JUN与合成型基因启动子区的结合被鱼藤酮增强，而被CoQ10减弱。以上结果证实OXPHOS受损后激活AP-1，促进合成型SMCs扩增。

      进一步的机制研究中，作者探索了触发OXPHOS--AP-1介导的表型转换的细胞外信号。Gene Ontology分析显示，在与收缩型SMC相比，纤维样和脂肪样SMCs中的AP-1共表达基因在多个肿瘤坏死因子（TNF）信号和细胞外基质相关通路中富集。此外， TNF基因集、纤维样及脂肪样SMCs的marker基因、AP-1亚基（FOS, FOSB, JUN, JUNB, JUND）对细胞进行评分，相关性分析显示TNF信号可能在参与了SMCs的表型转换。作者通过使用CellPhoneDB分析表达TNF配体的免疫细胞群与表达TNF受体的收缩型SMCs之间的TNF配体-受体相互作用情况，发现TNF信号在急性和亚急性AD中优先相互作用。

      接下来，作者探索了TNF对OXPHOS-AP-1信号轴的作用。TNF-α处理SMCs显著降低ATP水平、膜电位和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢(NADH)水平，而CoQ10共处理可逆转上述细胞效应。此外，CoQ10抑制TNF-α所致的SMCs上AP-1的表达、磷酸化和核内转位的上调。一致地，TNF-α介导的收缩型基因下调和合成型基因的升高可被CoQ10或AP-1抑制剂共处理而抑制。这些结果表明，TNF信号抑制OXPHOS后进而激活AP-1以促进合成型SMCs的扩增。

      最后，作者使用BAPN诱导的小鼠胸主动脉夹层（TAD）模型，进一步确定了OXPHOS-AP-1信号通路在体内胸主动脉夹层（TAD）进展中的作用。研究发现CoQ10或者AP-1特异性抑制剂T-5224显著降低了致死性AD的百分比，以及 TAD小鼠的主动脉环最大直径。组织学分析证实CoQ10或T-5224处理抑制TAD小鼠解剖性动脉瘤形成并改善主动脉中膜层退行性病变。此外，CoQ10或者T-5224抑制了SMCs由收缩型向合成型的表型转换。相反，AP-1激活剂TPA处理加速了BAPN诱导的死亡，促进了解剖性动脉瘤形成、中膜层退行性病变和合成型SMCs的扩增。以上数据证实OXPHOS-AP-1轴影响SMCs的表型转变从而参与调节BAPN诱导的小鼠TAD进程。

      综上所述，TNF信号通过抑制OXPHOS和随后的AP-1激活，促进合成型SMCs的增加。同时发现，通过靶向AP-1可以抑制SMCs的表型转换，从而缓解BAPN诱导的小鼠胸主动脉夹层。该研究揭示了TNF-OXPHOS-AP-1轴调控SMCs时间特异性表型转换中的重要作用，这一创新性研究成果为临床AD防治提供一个全新的策略。