背景介绍：荧光素酶（Luciferase）生物检测技术诞生于1990年，距今已有30多年的发展史，1993年第一个萤光素酶专利获批，1996年双萤光素酶报告基因检测系统推出，为研究者的实验提供了更加可靠的工具，成为萤光素酶技术历史上的里程碑事件。

荧光素酶是生物体内催化荧光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶多来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。

目前，以北美萤火虫（Photinus pyralis）来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个62kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有可被检测的酶活(张菊梅等, 2001)；另外，提取自海洋腔肠动物海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶也是一种可以催化荧光素发生荧光反应的单亚基特异活性蛋白，其分子量为36kDa。同萤火虫荧光素酶一样，该蛋白质在完成转录翻译后即具有催化活性(赵斯斯, 2012)。

图1 荧光素酶发光原理(赵斯斯, 2012)。（A）萤火虫荧光素酶催化反应原理；（B）海肾荧光素酶催化反应原理。

原理简介：荧光素酶报告基因检测是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，简称F-Luc）活性的一种报告系统。早年间的单荧光素酶检测系统由于其只有萤火虫荧光素酶，实验结果往往会受到各种实验条件的影响，目前已基本没人使用。之后的双荧光素酶报告基因检测系统在原有基础上引入了由固定组成型启动子驱动的以腔肠素（coelenterazine）为底物的海肾报告基因（Renilla luciferase，简称R-Luc）作为内参基因，可排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值除以海肾荧光素酶检测值即可。

miRNA/lncRNA/circRNA与靶基因调控研究

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA。一个miRNA可以靶向不同基因进行调节，同时同一个基因也可以被好几个miRNAs靶向。miRNA可以与编码基因mRNA的3’UTR结合也可以直接与circRNA或lncRNA结合来调控相关基因的表达。

将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入对应的miRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列，同理，这也可用于验证miRNA同lncRNA之间的靶向互作。

图12 我司验证miRNA与mRNA靶向互作时的载体构建原理图。

图13 我司验证miRNA与lncRNA靶向互作时的载体构建原理图。

文献举例

2019年10月15日，Chen等人在American Journal of Translational Research杂志上发表了题为“LINC01234 promotes multiple myeloma progression by regulating miR-124-3p/GRB2 axis.”的研究论文，在该文中作者通过临床数据评估确认lncRNA LINC01234可能在多发性骨髓瘤（MM）中发挥重要作用。接下来，作者通过细胞功能性实验验证以及体内裸鼠皮下成瘤实验，结合RNA-FISH、RIP、RNA pull down、双荧光素酶报告基因测定确定基于抗增殖、抗细胞周期进展和促凋亡的功能，LINC01234/miR-124-3p/GRB2信号轴可能有望成为MM治疗的有希望的候选者。

为了探索LINC01234潜在靶miRNA，作者通过miRDB在线数据库预测分析发现，LINC01234可能与miR-124-3p相互作用，转染miR-124-3p mimic后miR-124-3p水平显著上调（图14A）；接下来，又通过StarBase在线数据库确定了miR-124-3p与LINC01234之间存在的潜在结合位点（图14B），并通过双荧光素酶报告基因检测实验进行了验证，结果证明，在U266细胞中，miR-124-3p上调抑制LINC01234报告质粒的荧光素酶活性，而在miR-124-3p结合位点突变后没有显著影响（图14B）。

图14 双荧光素酶报告基因实验验证LINC01234与miR-124-3p结合位点（Chen et al., 2019）。

随后，作者通过TargetScan、miRDB和starBase在线数据库预测了miR-124-3p的靶基因，发现GRB2可能是miR-124-3p的潜在靶标（图15A）；在确定miR-124-3p与GRB2之间的潜在结合位点后（图15B），通过双荧光素酶报告基因检测实验进行了验证，结果证明，在RPMI-8226或U266细胞中，miR-124-3p上调降低了GRB2 3'UTR报告质粒的荧光素酶活性，而miR-124-3p结合位点突变后荧光素酶活性没有显著影响（图14B）。

转录因子调控/promoter活性研究

（1）启动子活性分析

启动子（Promoter）是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，可活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并具有转录起始的特异性，是基因的重要组成部分，其主要功能为调控基因表达（转录）的起始时间和表达程度。启动子的表达模式及强度可通过双荧光报告基因实验来检测。

目前，研究启动子功能应用较为广泛的方法为报告基因研究，将待测启动子构建至荧光素酶基因的上游，检测启动子的活性。

图例 我司验证启动子活性时的载体构建原理图。

文献举例

2016年12月9日，Pan等人在Molecular Cancer杂志上发表了题为“STAT3 signaling drives EZH2 transcriptional activation and mediates poor prognosis in gastric cancer.” 的研究论文，在该文中作者首先通过免疫组织化学染色法（IHC）检测了胃癌（GC）患者样本中STAT3、p-STAT3和EZH2的表达，发现它们均过度激活，且与晚期TNM分期和预后不良相关；随后通过双荧光素酶报告基因分析结合EMSA、ChIP分析，确定了EZH2表达是否受STAT3直接调控，STAT3介导EZH2上调。

采用siSTAT3转染SGC7901细胞后，发现STAT3 siRNAs降低了STAT3和EZH2的表达水平，而IL-6刺激可诱导高水平的STAT3和EZH2（图7A-C）。之后，用不同荧光素酶报告载体（包含全长启动子（区域1）、仅包含STAT3结合位点的区域（区域3）、不包含结合位点的区域（区域2））转染SGC7901细胞，结果在包含STAT3结合位点的区域1和区域3中检测到EZH2较高活性（图7D）；同时，结果还发现，具有全长EZH2启动子（-1702/+52）的双荧光载体在有或没有IL-6刺激的情况下可通过siSTAT3处理而使其失活（图7E）。为保证实验的可靠性，作者同是采用ChIP与EMSA实验对其进行了验证（图7F、G）。

图例 STAT3可增强GC细胞中的EZH2启动子活性（Pan et al., 2016）。

（2）转录因子与启动子调控机制研究

转录因子（Transcription factor，TF）是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子，可与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用。一些转录因子仅与其靶基因启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。双荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶基因启动子中的特异顺式元件结合的重要手段。

将启动子区域插入双荧光素酶报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达对应的转录因子，可分析转录因子过表达是否提高或降低荧光素酶活性。

图例 我司验证特定转录因子与启动子互作时的载体构建原理图。

文献举例

2021年3月4日，Xiang等人在Theranostics杂志上发表了题为“Cellular senescence in hepatocellular carcinoma induced by a long non-coding RNA-encoded peptide PINT87aa by blocking FOXM1-mediated PHB2.”的研究论文，在该文中作者首先通过体内外实验检测了PINT87aa和截短PINT87aa功能，同时结合细胞功能实验进行验证；随后，结构分析预测、免疫共沉淀、免疫荧光共定位证实了PINT87aa与转录因子FOXM1之间可能的结合，并在FOXM1过表达后，进行了体内外回补实验。最后，作者还进行了双荧光素酶报告基因测定与ChIP实验，以验证FOXM1与PHB2启动子的结合（图9）。

图9 FOXM1可促进PHB2转录（Xiang et al., 2021）。

（3）启动子结构分析

目前，对启动子的分析重点大多集中于对启动子中各调控元件，即各种转录因子的DNA识别/结合位点，这些元件通常较为保守，长度较短，从几个碱基到十几个碱基不等。

将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入双荧光素酶报告载体，检测其启动子活性，进而确定启动子中的核心元件。

图例 我司分析启动子结构时的载体构建原理图 。

文献举例

2013年10月16日，Qu等人在PLOS ONE杂志上发表了题为“Different involvement of promoter methylation in the expression of organic cation/carnitine transporter 2 (OCTN2) in cancer cell lines.”的研究论文，在该文中作者研究了CpG岛甲基化作为导致癌细胞系中OCTN2下调的可能机制，通过使用甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐基因组测序和体外甲基化测定，发现启动子DNA甲基化是抑制癌细胞系中OCTN2表达的重要机制的证据，应用去甲基化试剂可调节OCTN2启动子的甲基化状态，促进OCTN2表达，并致使癌细胞对奥沙利铂（一种抗癌药）更敏感。

为了确定哪些甲基化CpG岛在OCTN2的下调中起重要作用，作者分别构建了带有未甲基化或甲基化区域的荧光素酶报告质粒，将构建的质粒转染到COS-7细胞中并用于评估转录活性，与对照相比，pGL4.17-Region1的荧光素酶活性显著增加，表明-354-+85 bp的区域在启动子活性中发挥重要作用（图11）。

图11 双荧光素酶报告基因测定甲基化对OCTN2启动子转录活性的影响（Qu et al., 2013）。

图15 双荧光素酶报告基因实验验证miR-124-3p与其靶基因GRB2的结合位点（Chen et al., 2019）。